哈工大全媒体（刘培香 张德龙 文/图）近日，哈工大仪器学院李浩宇教授团队在超分辨荧光显微成像技术领域取得突破性进展。针对目前超分辨荧光显微图像重建质量难以有效精确评估的问题，该团队提出了一种像素级的误差量化方法，利用滚动傅里叶环相关计算方法（rolling Fourier ring correlation，rFRC），评估超分辨尺度下的图像重建不确定度（基于超分辨成像在超高分辨能力的层面上对更微细结构进行成像测量的不确定度），在无需比对参考图像的条件下，通用地生成超分辨尺度下像素级的误差定量分布图。该项技术可准确描绘出生物分析并精确定位可靠性较低的区域，相比图像不确定分析领域内现有的方法，其判定尺度的精细程度最高可提升近10倍。12月14日，该研究成果以《滚动傅里叶环相关定量超分辨显微成像质量异质性分析和评定》（Quantitatively mapping local quality of super-resolution microscopy by rolling Fourier ring correlation）为题，以长文形式在线发表于《自然》（Nature）杂志旗下的国际权威光学期刊《光：科学与应用》（Light: Science & Applications，2022年影响因子20.3）。

通过设置荧光探针或结合物理的受激辐射现象，超分辨荧光显微镜已经突破了分辨率的物理衍射极限（200～300纳米）。然而，超分辨显微镜对样本的超分辨信息提取能力，往往依赖于图像的计算重建与后续处理，而化学环境和光学设置等因素会在重构中对图像产生影响，造成噪声与失真，降低超分辨图像质量。因此，对超分辨图像进行精确可靠的质量评估，可有效量化误差和不确定性，从而进一步分析生命科学问题。尽管目前已有几种方法可对超分辨图像质量进行评估，但还无法在超分辨尺度上进行超精密且无参考的量化分析，且难以准确评价图像分辨率分布的异质性。

为解决上述问题，李浩宇教授团队针对图像的像素级细小误差，采用滚动傅里叶环相关计算在超分辨尺度上进行量化和估计。与此同时，对于较大的结构失真等错误，引入改进的分辨率比例尺误差图（RSM），最终构成一套完善的超分辨尺度显微图像重建质量评估方案（Pixel-level ANalysis of Error Locations-PANEL，像素级图像误差定位分析）。利用该项技术可以精确比较不同单分子定位显微镜重建算法的性能，并进一步促进超分辨率尺度下不同重建图像的有效融合，最大限度降低了潜在误差。此外，该方法还能够与目前常用的多种模态光学超分辨显微成像技术结合，成为一种易于使用的图像局域质量评估分析工具。

利用该方法可以有效评估单分子定位显微镜（STORM）分辨率异质性。这里展示的是单分子定位显微镜拍摄的微管数据集对提出的评估方法进行验证（如下图左），从图中给出的不确定量化评价和分辨率分布地图，证明该方法成功绘制出微管密集程度变化引起的分辨率异质性（如下图右）。

rFRC评估单分子定位显微镜的超分辨率图像。

左：于COS-7细胞中用Alexa Fluor647标记的α-微管蛋白的 STORM重建结果（四周）与其rFRC图（中央）；

右：STORM 结果（亮绿色）和高斯平均 rFRC 图（shifted jet图）的合并视图，用于突出显示低质量区域。

超分辨荧光显微技术虽然突破了分辨率的衍射极限，使得科学问题可以进一步在更小尺度对微观世界直接探索和感知，但在看得清不清之外，看得准不准和看得真不真实依旧是生命科学研究探索中的重大阻碍。只有明确知道超分辨成像测量的不确定度，才能指导我们走向更高的成像分辨率与质量。因此，提出新的量化分析技术在超分辨的精细尺度，以像素级准确量化误差能力，揭示了图像空间信息的不确定性和分辨率分布的异质性，不仅告诉我们超分辨结果的准确度，基于超分辨图像的生物分析提供了重要支持，还可利用量化评估信息，对不同重建方法甚至不同模态的超分辨结果融合利用，最大限度降低误差，充分利用高频空间的超分辨信息，进一步提升图像的整体分辨率。除此之外，该方法原理的通用性使其可以广泛用作跨模态工具，评估其他基于定位和基于波动的显微镜的分辨率异质性，在生物显微成像技术领域有望成为广泛应用的生物数据分析评定方法，推动计算显微成像技术领域获得更大的进步和应用价值。

该项研究成果主要由哈工大仪器学院、北京大学未来技术学院和南开大学物理学院合作完成。哈工大为论文第一通讯单位，哈工大助理教授赵唯淞为论文第一作者，哈工大李浩宇教授和北京大学陈良怡教授为论文通讯作者。北京大学助理教授黄小帅和南开大学博士后杨建宇为论文共同第一作者，共同通讯作者还有南开大学潘雷霆教授和北京大学赵士群副研究员。哈工大仪器科学与技术学科带头人谭久彬院士为论文共同作者和哈工大科研团队负责人。

该项工作受到国家自然科学基金项目（优秀青年科学基金、国家重大科研仪器研制项目）和科技部重点研发计划（前沿生物技术）等项目资助。

论文链接：https://doi.org/10.1038/s41377-023-01321-0